紫外可見(jiàn)分光光度計的原理是利用物質(zhì)的分子或離子對某一波長(cháng)范圍的光的吸收作用，對物質(zhì)進(jìn)行定性分析，定量分析及結構分析，所依據的光譜是分子或離子吸收入射光中的特定波長(cháng)的光而產(chǎn)生的吸收光譜。根據所吸收光的波長(cháng)區不同，分為紫外分光光度法和可見(jiàn)光光度法，合稱(chēng)為紫外可見(jiàn)分光光度法。

      紫外可見(jiàn)分光光度法是研究物質(zhì)在紫外可見(jiàn)光波下的分子吸收光譜的分析方法，在光的性質(zhì)中200-400nm波長(cháng)的光叫做紫外（UV），從400-800nm叫做可見(jiàn)（VIS），從800nm到近1毫米是紅外（IR）。僅可見(jiàn)光才能被我們的眼睛看見(jiàn)，而包含所有波長(cháng)的光，包括紫外，可見(jiàn)光和紅外叫做白光（例如太陽(yáng)光），太陽(yáng)光發(fā)出的白光可以通過(guò)棱鏡濾光片等分成七種類(lèi)似彩虹的顏色，白光即包含所有波長(cháng)的光，單色光即單波長(cháng)的光。

      根據朗伯比爾定律：A＝kbc表明：一定溫度下，一定波長(cháng)的單色光通過(guò)均勻的、非散射的溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

      A＝kbc式中:

      A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

      k：摩爾吸光系數，單位L·mol－１·cm－１；

      b：液層厚度(光程長(cháng)度)，通常以cm為單位；

      c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

      我們可以舉個(gè)小例子來(lái)說(shuō)明一下，有甲乙兩個(gè)相同材質(zhì)的玻璃杯，其中甲裝有潔凈的水而乙裝的是渾濁的水把它們放在靠窗的地方，這時(shí)甲可以透過(guò)大部分的光，而乙則沒(méi)有那么多光透過(guò)，在這里透過(guò)的光的比率稱(chēng)為透射比，透射比通常以百分比形式來(lái)表示（%T）相反的從窗口透過(guò)的的光被吸收比率*叫做吸收率（Abs）。

      物質(zhì)對光的吸收是選擇性的，利用被測物質(zhì)對某波長(cháng)的光的吸收來(lái)了解物質(zhì)的特性，通過(guò)測定被測物質(zhì)對不同光的吸收強度，以波長(cháng)為橫坐標，吸光度為縱坐標即可得出該物質(zhì)在測定波長(cháng)范圍的吸收曲線(xiàn)。在吸收曲線(xiàn)中，通常選用*大吸收波長(cháng)進(jìn)行物質(zhì)含量的測定。例如蘋(píng)果是紅色的，為什么蘋(píng)果看上去是紅色的而不是別的顏色？*好比我們對某種顏色喜歡一樣，物質(zhì)對顏色也有偏好，當某種物質(zhì)暴漏包含各種顏色的光中時(shí)，它吸收并僅保存了光中它*喜歡的顏色，它不喜歡的顏色被反射，這*形成了我們眼中看到的某種物質(zhì)的顏色。

      根據這一特性我們即可通過(guò)顏色密度來(lái)對物質(zhì)進(jìn)行定量分析以此來(lái)測定某種物質(zhì)（溶液）的含量，例如我想測自來(lái)水里的鐵，通常無(wú)法直接采用分光光度法進(jìn)行測量，因此在這種方式測定中需要添加與目標物質(zhì)反應顯色的著(zhù)色試劑，里面含鐵越多則顏色*越深（高吸光度）少則相反。這時(shí)我們需要配置標準溶液的校正曲線(xiàn)，從低到高來(lái)測量標準濃度的吸光值獲得該測量的校正曲線(xiàn)。在定量分析中還要考慮物質(zhì)的吸收波長(cháng)，通過(guò)觀(guān)察測量已經(jīng)著(zhù)色的吸收光譜來(lái)選擇吸收*大而相對平滑的波長(cháng)（現在多數儀器已能自動(dòng)測量物質(zhì)的*佳吸光率如HACH的DR3900）。

      實(shí)際測量時(shí)光譜與測定條件也有密切的關(guān)系，測定條件如溫度，溶劑極性等不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強度等都可能發(fā)生變化。對于溶劑的選擇要注意盡量選用低極性溶劑同時(shí)能很好的溶解被測物，并形成溶液具有良好的化學(xué)性質(zhì)和光化學(xué)的穩定性，溶劑在樣品的吸收光譜區無(wú)明顯的吸收并注意保證實(shí)踐條件的一致性，這樣既能保證*小誤差又可達到*佳的測量結果。

紫外可見(jiàn)分光光度計的機理：

      盡管我們可以通過(guò)感知物質(zhì)的顏色來(lái)預測總的吸收波長(cháng)，但無(wú)法進(jìn)行*的波長(cháng)分析，而且還可能存在著(zhù)個(gè)體差異，另外人眼也無(wú)法觀(guān)測到紫外線(xiàn)區。而在紫外可見(jiàn)分光光度計的系統中不存在個(gè)體的差異，原因是在分光光度計中使用人造光源來(lái)代替白光，光不是直接照射在物體上的，而是通過(guò)棱鏡或衍射光柵將白光分成許多顏色，然后每種顏色（單色光）分別掃描物體來(lái)測量物質(zhì)的吸收波長(cháng)。

紫外可見(jiàn)分光光度計的基本構造：

      分光光度計主要由光源、單色器（分光鏡）、吸收池、檢測器和顯示器五大部分組成。

      光源：在整個(gè)紫外光區或可見(jiàn)光區可以發(fā)射連續光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩定性、較長(cháng)的使用壽命，可見(jiàn)光區常用的光源是鎢燈或碘鎢燈，波長(cháng)范圍是350-1000nm。在紫外區常為氫燈或氘燈，發(fā)射的連續波長(cháng)范圍是180-360nm。

      單色器：是將光源輻射的復合光分成單色光的光學(xué)裝置。它是分光光度計的心臟部分。單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統組成。關(guān)鍵是色散元件，*常見(jiàn)的色散元件是棱鏡和光柵。

      ?狹縫：將單色器的散射光切割成單色光。直接關(guān)系到儀器的分辨率。狹縫越小，光的單色性越好。分為入射狹縫和出射狹縫。

      ?棱鏡：175-2700nm的光能被分開(kāi)，色散隨波長(cháng)變化，波長(cháng)長(cháng)色散差，材質(zhì)主要有水晶和溶凝石英。

      ?光柵：色散在整個(gè)波長(cháng)范圍內是統一的。1個(gè)衍射光柵能獲得寬波長(cháng)。另外，用常量狹縫寬度能獲得常量光譜。因此具有波長(cháng)范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便的優(yōu)點(diǎn)。

      樣品池：用于盛裝試液的裝置。吸收材料必須能夠透過(guò)所測光譜范圍的光。一般可見(jiàn)光區使用玻璃吸收池，紫外光區使用較貴的石英吸收池。測量時(shí)要挑選配對，因為吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程長(cháng)度的精度等參數對分析結果都有影響。

      檢測器：用光電效應將透過(guò)吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。它的作用是充當在紫外和可見(jiàn)區有靈敏性的光電管和放大器的作用。要求靈敏度高、響應時(shí)間短、噪聲水平低、穩定性好等性質(zhì)。

      顯示器：將檢測到的信號輸出顯示出來(lái)，能直觀(guān)的對結果進(jìn)行觀(guān)看分析。

分光光度計的分類(lèi)：

      一般有可見(jiàn)分光光度計，紫外分光光度計，可見(jiàn)紫外分光光度計，紅外分光光度計等。按儀器使用的光學(xué)系統還分為單光束、雙光束、多波長(cháng)光度計等。

單光束：經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種光度計的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單便宜適于在給定波長(cháng)處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩定性。

      雙光束：經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強度相等的兩束光，一束通過(guò)參比池，一束通過(guò)樣品池。光度計能自動(dòng)比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數變換將它轉換成吸光度并作為波長(cháng)的函數記錄下來(lái)。一般具備快速全波段掃描?？上庠床环€定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結構分析。此種儀器操作復雜價(jià)格較高。

      雙波長(cháng)：由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長(cháng)的單色光；通過(guò)折波器以一定的頻率交替通過(guò)同一樣品池，然后由檢測器交替接收信號，*后由顯示器顯示出兩個(gè)波長(cháng)處的吸光度差值從而扣除了背景吸收的吸光度，達到更*的測量效果。